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      1. 實驗技術

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        MTT(四唑鹽)比色法

        添加日期:2018年03月30日 關鍵字: 點擊次數:885 次

        導讀:四唑鹽(MTT)比色法可以:(1)檢測細胞存活和生長;(2)大規模的抗腫瘤藥物篩選;(3)細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定;(4)生物活性因子的活性檢測。

          實驗方法原理:MTT法是Mosmann 1983年報道的,以后此方法得到了迅速發展并廣泛應用于臨床與科研研究。其原理是活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍紫色產物(formazan),并沉淀在細胞中,而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜(DMSO)能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物,溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值。

          實驗材料:細胞樣品

          試劑、試劑盒:PBS,DMSO,胰蛋白酶,甘氨酸緩沖液,二甲亞楓

          儀器、耗材:加樣器,96孔培養板,酶標儀,培養板

          實驗步驟:

          一、實驗前應明確的問題

          1.  選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下,96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大,因此,在進行MTT試驗前,要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線,確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間,以保證培養終止致細胞過滿。這樣,才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多敏感性降低,太少觀察不到差異。

          2.  藥物濃度的設定。一定要多看文獻,參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記!否則,可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。

          3.  時間點的設定。在不同時間點的測定OD值,輸入excel表,最后得到不同時間點的抑制率變化情況,畫出變化的曲線,曲線什么時候變得平坦了(到了平臺期)那個時間點應該就是的時間點(因為這個時候的細胞增殖抑制表現的最明顯)。

          4.  培養時間。200 ul的培養液對于10的4~5次方的增殖期細胞來說,很難維持68 h,如果營養不夠的話,細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止,影響結果,我們是在48 h換液的。

          5.  MTT法只能測定細胞相對數和相對活力,不能測定細胞絕對數。做MTT時,盡量無菌操作,因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。

          6.  理論未必都是對的。要根據自己的實際情況調整。

          7.  實驗時應設置調零孔,對照孔,加藥孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜,不同的是對照孔加溶解藥物的介質,而加藥組加入不同濃度的藥物。

          8.  避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養液培養細胞時,高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加,會試驗敏感性。因此,一般選小于10%胎牛血清的培養液進行。在呈色后,盡量吸凈培養孔內殘余培養液。

          二、貼壁細胞

          1.  收集對數期細胞,調整細胞懸液濃度,每孔加入100 ul,鋪板使待測細胞調密度至1 000-10 000孔,(邊緣孔用無菌PBS填充)。

          2.  5% CO2,37℃孵育,至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物,原則上,細胞貼壁后即可加藥,或兩小時,或半天時間,但我們常在前一天下午鋪板,次日上午加藥。一般5-7個梯度,每孔100 ul,設3-5個復孔.建議設5個,否則難以反應真實情況。

          3.  5% CO2,37℃孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀察。

          4.  每孔加入20 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5% MTT),繼續培養4 h。若藥物與MTT能夠反應,可先離心后棄去培養液,小心用PBS沖2-3遍后,再加入含MTT的培養液。

          5.  終止培養,小心吸去孔內培養液。

          6.  每孔加入150 ul二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

          7.  同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)

          三、懸浮細胞

          1.  收集對數期細胞,調節細胞懸液濃度1×106/ml,按次序將

         ?。?)補足的1640(無血清)培養基40 ul ;

         ?。?)加Actinomycin D(有毒性)10 ul用培養液稀釋 (儲存液100 ug/ml,需預試尋找最佳稀釋度,1:10-1:20);

         ?。?)需檢測物10 ul;

         ?。?)細胞懸液50 ul(即5×104cell/孔),共100 ul加入到96孔板(邊緣孔用無菌水填充)。每板設對照(加100 ul 1640)。

          2.  置37℃,5% CO2孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀察。

          3.  每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5% MTT),繼續培養4 h。(懸浮細胞推薦使用WST-1,培養4 h后可跳過步驟4),直接酶聯免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值)

          4.  離心(1000轉x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值。  

          5.  同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜),每組設定3復孔。

          四、MTT的配制

          MTT一般現用現配,過濾后4oC避光保存兩周內有效,或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存,避免反復凍融,小劑量分裝,用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里,用的時候現配,直接往培養板中加,沒必要一下子配那么多,尤其當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了。

          MTT有致癌性,用的時候小心,有條件帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌,MTT對菌很敏感;往96孔板加時不避光也沒有關系,畢竟時間較短,或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉.

          配制MTT時用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配,60℃水浴助溶。

          1.  PBS配方

         ?。?)NaCl :8 g。

         ?。?)KCl 0.2:g。

         ?。?)Na2HPO4 :1.44 g。

         ?。?)KH2PO4:0.24 g。

         ?。?)調pH7.4。

         ?。?)定容1 L。

          五、細胞的接種(鋪板)

          細胞過了30代以后就不要用了,因為狀態不好了;培養板要用好的(進口板),不好的板或重復利用的板只可做預實驗。

          接種時按照預實驗摸索出的密度接種, 因為細胞密度在10000/ml左右時,所測得的OD值的區間即細胞抑制率(或者增值率)的所呈現的線性關系,結果最可信。如果鋪的太稀細胞的殺傷不會很明顯,太密細胞可能都會凋亡,因為細胞長的太快營養會不夠,最后導致死亡。且而細胞過密或者過少,增殖都會過快或者過慢,其增值率線性關系不佳。故而MTT細胞密度多采用10000/ml,100 ul/孔。

          細胞密度要根據不同細胞的特點來定.如果你做的藥品對細胞具有刺激作用那么取小點的細胞濃度,如果你做的藥品對細胞具有抑制作用那么取大點的細胞濃度,這樣與對照的區別更明顯,數據更好。懸浮細胞每孔的細胞數可達到105,貼壁細胞可為103-104。

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